SABiosciences公司新近推出了第二代功能分類基因芯片。該芯片基于SABiosciences公司開發的200多種 Oligo基因芯片（第***代功能分類基因芯片），結合了實時定量PCR和第***代功能分類基因芯片的優點，可在***次實驗中準確定量檢測上百個基因的mRNA水平。
SABiosciences公司在第二代功能分類基因芯片的研發過程中，攻克了從反應體系優化到基因準確定量等多方面的技術難點。該芯片不僅克服了實時定量PCR檢測基因表達工作量大、耗時久的缺點，而且將基因芯片的檢測精度提高到了與實時定量PCR相當的水平。
1、引物設計嚴謹
SYBR Green可與所有的雙鏈DNA反應（包括引物二聚體），為了使擴增反應集中于目的基因，避免非特異性擴增，引物設計成為關鍵因素。為得到單***特異的擴增產物，避免擴增出序列相似的非特異性產物，采用BLAST或者其他比對方法，檢測引物在相應物種（如人，小鼠或大鼠）全基因組中的特異性。為了保證在相同的PCR條件下（特別是統***的退火溫度），不同基因均能擴增出相應的特異性產物，對引物的CG值，解鏈溫度（Tm），以及其他化學和物理的特性都進行了優化調整。為了獲得高擴增效率，對擴增片段的長度也進行了優化，***般為100到200bp，確保在統***的循環反應的時間范圍內，不同基因均能擴增出完整片段。
2、反應體系優化
為避免非特異性擴增，使用化學修飾的熱啟動Taq酶，只有經過熱激步驟，Taq酶才能發揮擴增活性。同時，反應體系經過優化，可***大限度減少引物二聚體形成，并且保證較難擴增的片段都得到極高的擴增效率。
3、定量結果可靠
在標準的96孔PCR反應儀中進行實時定量PCR實驗，為了獲得高通量，無法為每個樣品單獨制備標準曲線。在完全相同的PCR反應條件下，希望表達量不同的多個基因均獲得可靠的結果，需要確保每個基因都有較高的擴增效率，從而可采用簡單的△△Ct方法計算基因表達量。
SABiosciences第二代功能分類基因芯片
第二代功能分類基因芯片與第***代功能分類基因芯片共同之處在于，對基因按照信號通路或者功能進行有目的的分類和篩選，避免了高通量基因芯片因數據過多而難以分析的缺點，數據分析直接高效。而相較第***代功能分類基因芯片，第二代功能分類基因芯片還具有以下的優越性：使用芯片即可達到實時定量PCR的精度，實驗結果無須再進行實時定量PCR驗證。
靈敏度高 擴增效率好——總RNA量***低可至0.5ng，擴增效率達到*** |
圖1：模板為人總RNA（GA-004）的10倍梯度稀釋樣品，采用人炎癥細胞因子和受體芯片（APH-011A），分別檢測看***基因和炎癥特異性基因的表達。以Ct值為縱坐標和RNA樣品量為橫坐標作圖。樣品量***少為0.5ng，線性范圍達到105（0.5ng到5ug）。斜率均值為-3.26±0.41，說明擴增效率達到約*** |
圖2：正常乳腺組織和乳腺癌的總RNA（BioChain Institute，Inc.，5.0ug）反轉錄為cDNA作為模板。采用人癌癥信號通路發現者芯片（APH-033A），實驗重復三次。不同樣品線性范圍均可達到105；在不同的樣品稀釋度下，同***看***基因的相對表達量均相同。 |
圖3：為檢測芯片重復性，對兩種不同樣品分別進行3次重復，共6次實驗。A顯示89個基因（包括84個通路特異性基因和5個看***基因）Ct值的均值，并且每個點上均標明相應的標準差。可見Ct值低時，重復性好（誤差范圍?。?，Ct值高，重復性較差（誤差范圍較大），與實時定量PCR的預期結果***致。B說明，Ct值標準差均值約為0.25個循環。因此，對于大多數基因（Ct值小于30），超過2倍的表達差異（顯著性差異）可以準確測出。C通過Ct值的CV值檢測重復性。同樣，CV值低表明重復性好。 |
特異性高——產物特異性高，可區分同***樣品中的同源基因 |
圖4：為檢測第二代功能基因芯片的特異性，單獨測定每個基因的熔解曲線，隨后進行凝膠電泳檢測。結果表明，熔解曲線和凝膠電泳結果***致，熔解曲線均只出現***個峰，電泳圖中只有單***條帶，條帶大小與預期結果***致。因此，芯片檢測結果特異性高，可以區別RNA樣品中同***基因***族的同源基因。 |
綜上所述，第二代功能分類基因芯片，由于其靈敏度高，樣品的使用量低，每張芯片使用的總RNA***少可為0.5ng；可觀察到的動態線性范圍超過105，可以同時檢測表達量差異較大的基因；Ct值的平均差異只有0.25個循環，可檢測超過兩倍的基因表達量變化。因此，第二代功能分類基因芯片是研究特定信號通路或者***組功能相關基因表達量的理想方法。
滬公網安備31011502016460號
